實(shí)時(shí)
熒光-PCR法不僅具有普通PCR的高靈敏性，而且由于應(yīng)用了熒光探針，可通過(guò)光電傳導(dǎo)系統(tǒng)直接探測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)的變化以獲得定量結(jié)果，所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高準(zhǔn)確性，克服了常規(guī)PCR的許多缺點(diǎn)。
熒光-PCR法反應(yīng)體系中的引物和dNTP濃度：
1.定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對(duì)于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。因脫鹽而除去的苯甲?；彤惗□；苌伲虼瞬粫?huì)干擾PCR。部分應(yīng)用需要純化，以除去在合成過(guò)程中的任何非全長(zhǎng)序列。這些截?cái)嘈蛄械漠a(chǎn)生是因?yàn)镈NA合成化學(xué)的效率不是100％。這是個(gè)循環(huán)過(guò)程，在每個(gè)堿基加入時(shí)使用重復(fù)化學(xué)反應(yīng)，使DNA從3'到5'合成。在任何一個(gè)循環(huán)都可能失敗。較長(zhǎng)的引物，尤其是大于50個(gè)堿基，截?cái)嘈蛄械谋壤艽?，可能需要純化?/div>
2.引物的穩(wěn)定性依賴于儲(chǔ)存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲(chǔ)存在-20℃。定制引物以干粉形式運(yùn)輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好，因?yàn)樗膒H經(jīng)常偏酸，會(huì)引起寡核苷的水解。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個(gè)月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個(gè)月。
3.引物的濃度會(huì)影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。引物過(guò)多會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體,過(guò)低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計(jì),可精確計(jì)算引物濃度,在1cm光程比色杯中,260nm下,引物濃度可按下式計(jì)算：
X mol/L＝OD260/A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)。
X：引物摩爾濃度,A、C、G、T：引物中4種不同堿基個(gè)數(shù)。
4.不要使用寡聚核苷酸作為標(biāo)準(zhǔn)，在EB染色的膠上估算引物濃度，因?yàn)橐锖蜆?biāo)準(zhǔn)的染色能力根據(jù)序列不同而差異很大。
5.dNTP溶液呈酸性，普通廠家的dNTP溶液一般均未調(diào)pH，應(yīng)用1mol/l NaOH或1M Tris.HCL的緩沖液將dNTP貯存液pH調(diào)至7.0，以保證反應(yīng)的pH值不低于7.1。再用紫外分光光度計(jì)定量。配成5-10mmol/L并分裝,-20℃貯存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。
6.決定低dNTP濃度的因素是靶序列DNA的長(zhǎng)度和組成，理論上在100μl反應(yīng)體系中，4×dNTPs濃度若用20μmol/L，基本滿足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列,50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μg DNA,而200μmol/L足以合成25μg/DNA。
7.在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50-200umol/L，當(dāng)dNTP終濃度大于50mmol/L時(shí)可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4種dNTP的濃度應(yīng)該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入。
8.dNTP含有磷酸根，能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。其濃度變化將影響Mg2+的有效濃度。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中4×dTNPs的總濃度為0.8mmol/L，低于1.5mmol/L的Mg2+濃度。因此，在高濃度DNA及dNTP條件時(shí)，必須相應(yīng)調(diào)整Mg2+的濃度。
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